Дизайн и скрининг новых молекулярных соединений, нацеленных на лактатдегидрогеназу бабезийских микроти — паразиты и векторы

Создание базы данных структурной модификации DHNA

Основываясь на взаимодействии между соответствующими аминокислотными остатками в активном сайте BMLDH и DHNA, модификации были внесены в DHNA путем изменения положения карбоксильных и гидроксильных групп и вводя различные группы боковых цепей. Программное обеспечение Discovery Studio (V18.1.100.18065) ​​использовалось для разработки малых молекул -структур и генерации наборов этих структур. Модули «подготовка лигандов» и «минимизировать лиганды» использовались для уточнения и оптимизации коллекций структур.

Молекулярная стыковка

Структура белка BMLDH (PDB вступление в действие № 6K13) была извлечена из банка данных белка и предварительно обработана с использованием программного обеспечения Discovery Studio. Полученные данные использовались в качестве данных рецепторов для последующих анализов. Первоначально Libdock был использован для составления рецепторов и лигандов, и 100 лучших конформаций были отобраны на основе их баллов. Эти мелкие молекулы, идентифицированные их лучшими оценками Libdock, затем подвергались стыковке Cdocker. В гибком процессе стыковки ARG99 был обозначен как гибкий остаток, а 100 лучших молекул были выбраны на основе их оценки энергии CDocker.

Синтез

Два соединения, TA и TB, были синтезированы по указанному маршруту синтеза (дополнительный файл 1: Дополнительный рис. 1).

Синтез составной ТА

Соединение 2: к охлажденному раствору соединения 1 (19 г, 85,2 ммоль, 1 уравнение) в НеВНе-диметилформамид (DMF) (170 мл) при 0 ℃, триизопропилсилилхлорид (TIPTCL) (21,4 г, 110,7 ммоль, 23,7 мл, 1,3 уравнения), имидазол (12,2 г, 178,9 ммоль, 2,1 уравнение) и 4-диметил (DMAPYRIN ) (2,1 г, 17,0 MMOL, 0,2 уравнения) были добавлены. Реакционную смесь позволяли нагреваться до 15–20 ℃ и перемешивали в течение 6 часов.

Соединение 3: колба 1: часть (60 мл) раствора соединения 2 (24 г, 63,23 ммоль, 1 уравнение) в тетрагидрофуране (ТГФ) (300 мл) добавляли в высушенную флажку, содержащуюся в магнии (1,5 г , 62,1 ммоль, 0,98 уравнения) и йод (160,6 мг, 632,6 мкмоль, 127,4 мкл, 0,01 уравнение) в атмосфере азота. Смесь нагревали до 65–70 ℃, а оставшиеся 240 мл сопоставки BROMO добавляли с каплей с скоростью для поддержания рефлюкса. После того, как добавление было завершено, темный раствор перемешивали при 65–70 ℃ в течение 1 часа, затем охлаждали до 15–20 ℃. Коляска 2: раствор фталического ангидрида (9,4 г, 63,3 ммоль, 1 уравнение) в ТГФ (120 мл) нагревали до 65–70 ℃. Раствор из колбы 1 затем добавляли капли в течение 1 часа и перемешивали при 65–70 ℃ в течение 4 часов. Реакционную смесь охлаждали до 15–20 ℃ и гасили путем добавления 2 М HCl до тех пор, пока pH не регулируется до 2–3 при -10 до 0 ℃.

Соединение 4: Палладий на углерод (PD/C, 1,1 г, 1,7 ммоль, 10% чистота) добавляли в раствор соединения 3 (11 г, 24,5 ммоль, 1 уксусная кислота (ACOH, 110 мл) под азота атмосфера. Суспензию дегрессировали в вакууме и несколько раз очищали водородом. Смесь перемешивали при водороде (40–50 фунтов на квадратный дюйм) при 60–70 ℃ в течение 24 часов. Смесь перемешивали при водороде (40–50 фунтов на квадратный дюйм) при 60–70 ℃ в течение дополнительных 6 часов.

Составной цель A (TA): TBAF (1 м, 20,9 мл, 1,3 уравнения) добавляли в раствор соединения 4 (7 г, 16,1 ммоль, 1 уравнение) в ТГФ (80 мл), и смесь перемешивали при 15 –20 ℃ для 1 часа.

Синтез соединения туберкулеза

Соединение 6: Коак (8,6 г, 87,3,3 ммоль, 2 уравнения), даже если они₂ (1,3 г, 1,8 ммоль, 0,04 уравнения) добавляли в раствор соединения 5 (10 г, 43,7 ммоль, 1 уравнение) в 1,4-диоксане (100 мл) в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали при 80–85 ℃ в течение 4 часов.

Соединение 7: Соединение 6 (8 г, 28,9 ммоль, 1,4 уравнения), PD (DPPF) CL₂ (1,5 г, 2,1 ммоль, 0,1 уравнения) и k₂Сопутствующий₃ (14,6 г, 105,4 ммоль, 5 уравнение) добавляли в раствор соединения 2 (8 г, 21,1 ммоль, 1 уравнение) в 1,4-диоксане (80 мл) и ч₂O (19 мл) в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали при 80–85 ℃ в течение 8 часов.

Соединение 8: TBAF (1 м, 27,4 мл, 1,5 уравнения) добавляли в раствор соединения 7 (8,2 г, 18,3 ммоль, 1 уравнение) в ТГФ (80 мл), и смесь перемешивали при 15–20 ℃ для 2 часа

Соединенная цель B (TB): NaOH (2,7 г, 68,5 ммоль, 2,5 уравнения) добавляли в раствор соединения 8 (8 г, 27,4 ммоль, 1 уравнение) в MEOH (80 мл) и ч.₂O (160 мл). Смесь перемешивали при 15–20 ℃ в течение 3 часов.

Паразиты

А Б. Микроти Штамм ATCC PRA-99 ™ был поставлен Национальным институтом паразитических заболеваний, Китайским центром контроля и профилактики заболеваний (Шанхай, Китай). Этот штамм сохраняется в жидком азоте с добавлением диметилсульфоксида (ДМСО) в Национальной лаборатории сельскохозяйственной микробиологии, Сельскохозяйственный университет Хуажонга, Китай.

Выражение и очистка RBMLDH

Экспрессия и очистка RBMLDH проводились в соответствии с ранее установленным протоколом [19]Полем Вкратце, бактериальная культура PET-28A-BMLDH/BL21 (DE3), хранящейся при -80 ℃, была оттаивала и реанимирован. Чтобы вызвать экспрессию RBMLDH, изопропилтио-β-дюймовый-галактозид (IPTG) был добавлен, и культура инкубировали в 28 ℃. После достаточного индукции клетки собирали. Затем рекомбинантный BMLDH очищали с использованием аффинной хроматографической колонки Ni (GE Healthcare, Uppsala, Швеция) после инструкций производителя.

Поверхностные плазмонные резонансные (SPR) анализы

Свойства связывания RBMLDH с небольшими молекулярными соединениями оценивали с использованием системы Biacore T200 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) посредством поверхностного плазмонного резонансного (SPR). Чип сенсора CM5 был вставлен в систему Biacore T200 и промывово с буфером PBST (рН 7,5). Чтобы активировать чип датчика, смесь 1: 1 (об./Об.) 0,1 М NHS и 0,4 М EDC вводили при скорости потока 10 мкл/мин в течение 1200 с. Очищенные RBMLDH разбавляли до концентрации 25 мкг/мл в 10 мМ ацетатном буфере натрия (pH 4) и ковалентно иммобилизованный на чип CM5 при скорости потока 30 мкл/мин до уровня иммобилизации не достигнут 6100 RU. Реакция была остановлена ​​путем инъекции этаноламина. Новые мелкие молекулярные соединения, первоначально подготовленные в концентрации 100 мМ, дополнительно разбавляли в PBST до конечных концентраций от 20, 10, 5, 2,5, 1,25 и 0 мкМ. Протоковые ячейки 1 и 3 служили в качестве эталонных поверхностей, в то время как проточные ячейки 2 и 4 были обозначены как экспериментальные поверхности.

Анализ ингибирования ферментов

ТА и ТБ растворяли в ДМСО, чтобы создать 100 мм раствор. Система реакции, проводимая при 25 ℃, состояла из NACO₃ и Нахко₃ Буфер (рН 9,5) с общим объемом 200 мкл, содержащий 50 нг RBMLDH, 1,5 мм NAD⁺10 мм Л-Накака и различные концентрации соединений мелких молекул. Увеличение производства NADH контролировали спектрофотометрически в OD₃₄₀ (Оптическая плотность при 340 нм). IC₅₀ Значения для новых малых молекул -соединений были рассчитаны на основе этих результатов. Конечная концентрация ДМСО не влияла на активность RBMLDH, и все эксперименты проводились в трех экземплярах.

Ингибирующий эффект ТА и ТБ против роста Б. Микроти in vitro

Мыши BALB/C инокулировали 10⁷ Б. Микроти (100 мкл) через внутрибрюшинную инъекцию. Как только паразитемия достигла 60%, кровь собирала из хвостов мышей, и начальные процентные паразитированные эритроциты (PPE) разбавляли примерно до 0,8% с использованием эритроцитов здоровых мышей. ТА и туберкулеза готовили в виде 100 мМ растворов запаса и дополнительно разбавляли в градиенты концентрации 500 мкМ, 250 мкМ, 125 мкМ и 62,5 мкМ с ростом среды (HL-1 с добавлением 10 мкг/мг альбома I, 1% HB101, 200, 200 мкм Л-Glutamine, 2% антибиотиков/антимикотический 100 × и 20% плода -бычья сыворотка). В качестве положительного контроля использовали среду роста без препарата в качестве отрицательного контроля, в то время как 10 мкм ацетурат диминазена (DA) использовалась. Культуры инкубировали в течение 72 ч при 37 ℃ в газовой смеси 2% o₂5% co₂и 93% н₂ [23, 24]Полем После инкубации были подготовлены мазки крови, окрашены Giemsa, и была рассчитана частота паразитемии. Все эксперименты проводились в трех экземплярах.

Тест на цитотоксичность методом CCK-8

Линия Vero-клеточной линии без микоплазмы (ATCC-CCL-81, иммортализованные клетки) была криоконсервирована в жидком азоте с ДМСО в Национальной ключевой лаборатории сельскохозяйственной микробиологии, Сельскохозяйственного университета Хуажонга, Китай. Цитотоксичность соединений TA и ТБ оценивали в клетках Vero с использованием анализа CCK-8 (вазим). Вкратце, клетки Vero (100 мкл, 10000 клеток/лунку) культивировали в модифицированной Eagle Medium (DMEM) Dulbecco (DMEM), дополненной 10% плодом бычьей сывороткой (FBS) и 100 ед/мл пенициллин -стеретомицина при 37 ° с 5% CO₂ в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали различными концентрациями TA (2000, 1000, 500, 250 и 125 мкМ) или туберкулезом (800, 400, 200, 100 и 50 мкм) в течение 72 часов. После периода лечения среду, содержащей ТА и ТБ, заменяли свежей средой. Впоследствии в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8, и пластину инкубировали в течение дополнительных 3 часов. Поглощение измеряли при 450 нм с использованием многофункционального маркера фермента (Envision, PE, USA). Стоковые растворы TA и ТБ готовили при концентрации 100 мМ в абсолютном этаноле. Доксорубицин гидрохлорид при 40 мкм служил положительным контролем, в то время как 2% абсолютный этанол служил отрицательным контролем. Концентрация, необходимая для достижения 50% цитотоксичности (CC₅₀) значения были рассчитаны с использованием GraphPad Prism 8, и все анализы цитотоксичности были выполнены в трех экземплярах.